Práctica 18: Tinción de Ziehl-Neelsen

OBJETIVO

Determinar  las micobacterias que son ácido-alcohol resistente

MATERIAL Y REACTIVOS

·         Portaobjetos

·         Fuente de calor

·         Aceite de inmersión

·         Microscopio

·         Muestra (Cultivo bacteriano)

·         Fucsina fenicada

·         Alcohol-ácido (decolorante)

·         Azul de metileno

PROCEDIMIENTO

1.       Ponemos una gota de SSF en el porta.

2.       Tomamos una muestra de micobacterias.

3.       Homogenizamos la muestra y la extendemos sobre el porta.

4.       Desecamos y fijar con el mechero Bunsen.

5.       Cubrimos la preparación con fucsina fenicada durante 1 minuto.

6.       Colocamos sobre la preparación papel de filtro (para mantenerla húmeda)

7.       Añadimos fucsina

8.       Calentar durante 5 minutos a emisión de vapores.

9.       Lavamos con agua

10.   Decoloramos con alcohol ácido durante 30 segundos hasta eliminar el color rojizo.

11.   Añadimos azul de metileno como colorante de contraste durante 1-2 minutos.

12.   Lavamos, secamos y observamos al microscopio.

 

RESULTADO

Los BAAR se ven teñidos de rojo mientras que las no BAAR se ven de color azul

 

Práctica 17: B-galactosidasa (ONPG)

OBJETIVO

Determinar si la bacteria posee el enzima B-galactosidasa

PROCEDIMIENTO

1.       Depositamos un disco de ONPG en un tubo de ensayo con 1ml de solución salina estéril.

2.       Con el asa de siembra inoculamos una colonia.

3.       Incubamos a 37ºC durante 24 horas

RESULTADOS

Al observar formación de color amarillo debido a la presencia de B-galactosidasa, la prueba es positivo.  Si no hay cambio de color, la prueba será negativa (no hay B-galactosidasa)

 

Práctica 16: Fermentación del manitol

OBJETIVO

 Diferenciar S. aureus (fermenta el manitol) de de S. epidermidis y S. saprophyticus (no fermentan el manitol)

MATERIAL

·         Placa de Petri con medio Chapman

·         Mechero Bunsen

·         Asa de siembra

·         Estufa de cultivo

PROCEDIMIENTO

Sembramos por agotamiento de estrías en medio Chapman e incubamos durante 24 horas a 37ºC

RESULTADO

El medio vira a amarillo por lo que es S. aureus

 

Práctica 15: Coagulasa

OBJETIVO

Diferenciar S. aureus (coagulasa +) de S. epidermidis y S. saprophyticus (coagulasa -), viendo si la bacteria contiene la enzima coagulasa o no la contiene

MATERIAL

·         Tubo de ensayo

·         Plasma citratado

·         Bacteria (S. epidermidis)

·         Asa de siembra

·         Mechero de alcohol

·         Estufa de cultivo

PROCEDIMIENTO

Se inoculan algunas colonias en un tubo de ensayo con 0,5ml de plasma citratado y se incubar a 37º C

A las 4 horas observamos la formación del coágulo.

En el caso de dar negativo se reincuba toda la noche y se procede a su lectura a las 18-24horas

CONCLUSIÓN

No se observa la formación de un coágulo debido a que hemos utilizado S.epidermidis.

 

Una compañera ha utilizado S. aureus y se observa la formación del coágulo.

Práctica 14: Oxidasa

OBJETIVO

Diferencia pseudomonas (positivo) de enterobacterias (negativo)

MATERIAL Y REACTIVOS

·         Portaobjetos

·         Papel de filtro

·         Asa de siembra

·         Reactivo de Kovacs

PROCEDIMIENTO

Colocamos un trozo de papel de filtro en un portaobjetos.

Agregamos 2 -3 gotas del reactivo de Kovacs en el centro del papel.

Extendemos una colonia de 24 horas, con el asa de siembra, sobre el papel impregnado

RESULTADOS

Aparece color violeta por lo que es positiva

Práctica 13: Novobiocina

OBJETIVO

Diferenciar S. saprophyticus (resistente a la novobiocina) de S. epidirmidis (sensible a la novobiocina)

MATERIALES

·         Asa de siembra

·         Mechero de alcohol

·         Disco de novobiocina

PROCEDIMIENTO

Se siembra, en una placa de agar sangre o de TSA, haciendo estrías sobre un cuadrante en varias direcciones

Posteriormente se coloca, en el centro de la zona sembrada, un disco de novobiocina y se incuba la placa invertida durante  24 horas a 37ºC.

RESULTADO

Novobiocina sensible ya que nos sale un halo alrededor del disco.

La muestra es Staphylococcus epidermidis

Práctica 12: DNAsa

OBJETIVO

·         Estudiar la capacidad que tienen algunas bacterias para producir el enzima DNAsa, que produce la degradación del DNA que contiene el medio de cultivo.

·         Diferenciar las especies patógenas de Staphylococcus (DNAsa +) de las no patógenas (DNAsa -)

MATERIAL

·         Mechero Bunsen

·         Asa de siembra

·         Placa con medio rico en ADN

·         HCl o azul de toluidina 1%

·         Estufa de cultivo

PROCEDIMIENTO

En una placa con medio rico en ADN, sembramos la muestra, haciendo una estría.

Se incuba 24horas a 37ºC.

A las 24 horas añadimos HCl 1 N (que precipita el DNA), o azul de toluidina al 1%, y observamos la aparición de una halo alrededor de la zona sembrada.

CONCLUSIÓN

Se observa que la bacteria ha precipitado el ADN contenido en el medio.

El ácido clorhídrico revela la presencia de ADN del medio.