Práctica 18: Tinción de Ziehl-Neelsen

OBJETIVO

Determinar  las micobacterias que son ácido-alcohol resistente

MATERIAL Y REACTIVOS

·         Portaobjetos

·         Fuente de calor

·         Aceite de inmersión

·         Microscopio

·         Muestra (Cultivo bacteriano)

·         Fucsina fenicada

·         Alcohol-ácido (decolorante)

·         Azul de metileno

PROCEDIMIENTO

1.       Ponemos una gota de SSF en el porta.

2.       Tomamos una muestra de micobacterias.

3.       Homogenizamos la muestra y la extendemos sobre el porta.

4.       Desecamos y fijar con el mechero Bunsen.

5.       Cubrimos la preparación con fucsina fenicada durante 1 minuto.

6.       Colocamos sobre la preparación papel de filtro (para mantenerla húmeda)

7.       Añadimos fucsina

8.       Calentar durante 5 minutos a emisión de vapores.

9.       Lavamos con agua

10.   Decoloramos con alcohol ácido durante 30 segundos hasta eliminar el color rojizo.

11.   Añadimos azul de metileno como colorante de contraste durante 1-2 minutos.

12.   Lavamos, secamos y observamos al microscopio.

 

RESULTADO

Los BAAR se ven teñidos de rojo mientras que las no BAAR se ven de color azul

 

Práctica 17: B-galactosidasa (ONPG)

OBJETIVO

Determinar si la bacteria posee el enzima B-galactosidasa

PROCEDIMIENTO

1.       Depositamos un disco de ONPG en un tubo de ensayo con 1ml de solución salina estéril.

2.       Con el asa de siembra inoculamos una colonia.

3.       Incubamos a 37ºC durante 24 horas

RESULTADOS

Al observar formación de color amarillo debido a la presencia de B-galactosidasa, la prueba es positivo.  Si no hay cambio de color, la prueba será negativa (no hay B-galactosidasa)

 

Práctica 16: Fermentación del manitol

OBJETIVO

 Diferenciar S. aureus (fermenta el manitol) de de S. epidermidis y S. saprophyticus (no fermentan el manitol)

MATERIAL

·         Placa de Petri con medio Chapman

·         Mechero Bunsen

·         Asa de siembra

·         Estufa de cultivo

PROCEDIMIENTO

Sembramos por agotamiento de estrías en medio Chapman e incubamos durante 24 horas a 37ºC

RESULTADO

El medio vira a amarillo por lo que es S. aureus

 

Práctica 15: Coagulasa

OBJETIVO

Diferenciar S. aureus (coagulasa +) de S. epidermidis y S. saprophyticus (coagulasa -), viendo si la bacteria contiene la enzima coagulasa o no la contiene

MATERIAL

·         Tubo de ensayo

·         Plasma citratado

·         Bacteria (S. epidermidis)

·         Asa de siembra

·         Mechero de alcohol

·         Estufa de cultivo

PROCEDIMIENTO

Se inoculan algunas colonias en un tubo de ensayo con 0,5ml de plasma citratado y se incubar a 37º C

A las 4 horas observamos la formación del coágulo.

En el caso de dar negativo se reincuba toda la noche y se procede a su lectura a las 18-24horas

CONCLUSIÓN

No se observa la formación de un coágulo debido a que hemos utilizado S.epidermidis.

 

Una compañera ha utilizado S. aureus y se observa la formación del coágulo.

Práctica 14: Oxidasa

OBJETIVO

Diferencia pseudomonas (positivo) de enterobacterias (negativo)

MATERIAL Y REACTIVOS

·         Portaobjetos

·         Papel de filtro

·         Asa de siembra

·         Reactivo de Kovacs

PROCEDIMIENTO

Colocamos un trozo de papel de filtro en un portaobjetos.

Agregamos 2 -3 gotas del reactivo de Kovacs en el centro del papel.

Extendemos una colonia de 24 horas, con el asa de siembra, sobre el papel impregnado

RESULTADOS

Aparece color violeta por lo que es positiva

Práctica 13: Novobiocina

OBJETIVO

Diferenciar S. saprophyticus (resistente a la novobiocina) de S. epidirmidis (sensible a la novobiocina)

MATERIALES

·         Asa de siembra

·         Mechero de alcohol

·         Disco de novobiocina

PROCEDIMIENTO

Se siembra, en una placa de agar sangre o de TSA, haciendo estrías sobre un cuadrante en varias direcciones

Posteriormente se coloca, en el centro de la zona sembrada, un disco de novobiocina y se incuba la placa invertida durante  24 horas a 37ºC.

RESULTADO

Novobiocina sensible ya que nos sale un halo alrededor del disco.

La muestra es Staphylococcus epidermidis

Práctica 12: DNAsa

OBJETIVO

·         Estudiar la capacidad que tienen algunas bacterias para producir el enzima DNAsa, que produce la degradación del DNA que contiene el medio de cultivo.

·         Diferenciar las especies patógenas de Staphylococcus (DNAsa +) de las no patógenas (DNAsa -)

MATERIAL

·         Mechero Bunsen

·         Asa de siembra

·         Placa con medio rico en ADN

·         HCl o azul de toluidina 1%

·         Estufa de cultivo

PROCEDIMIENTO

En una placa con medio rico en ADN, sembramos la muestra, haciendo una estría.

Se incuba 24horas a 37ºC.

A las 24 horas añadimos HCl 1 N (que precipita el DNA), o azul de toluidina al 1%, y observamos la aparición de una halo alrededor de la zona sembrada.

CONCLUSIÓN

Se observa que la bacteria ha precipitado el ADN contenido en el medio.

El ácido clorhídrico revela la presencia de ADN del medio.

Práctica 11: Catalasa

OBJETIVO

Diferenciar Staphylococcus (catalasa positiva) de Streptococcus (catalasa negativa)

MATERIAL

·         Mechero Bunsen.

·         Asa de siembra.

·         Portaobjetos o tubo de ensayo.

·         Pipeta Pasteur.

·         Muestra de microorganismos.

·         Peróxido de hidrogeno.

PROCEDIMIENTO

1.       Rotulamos el portaobjetos.

2.       Encendemos el Mechero Bunsen y flameamos el asa de siembra.

3.       Enfriamos en un lateral y cogemos muestra.

4.       Depositamos la muestra en el portaobjetos y extendemos.

5.       Añadimos una gota de peróxido de hidrógeno.

6.       Observamos si hay burbujeo o no.

RESULTADO

Catalasa (+) Aparecen burbujas lo que significa que se ha formado O2  inmediatamente.

La muestra es Sthapylococcus.

 

Práctica 10: Tinción de Burri

OBJETIVO

Observar la cápsula de las bacterias capsuladas

MATERIAL Y REACTIVO

·         Portaobjetos

·         Asa de siembra

·         Mechero Bunsen

·         Suero salino fisiológico

·         Pinzas de madera

·         Fucsina diluida

·         Nigrosina al 1%

·         Paralelas

·         Cubeta de tinción

·         Frasco lavador con agua destilada

·         Microscopio óptico

·         Aceite de inmersión

PROCEDIMIENTO

1.       Realizamos un frotis utilizando un cultivo de 24 horas sin fijar

2.       Añadimos fucsina diluida durante 2 min

3.       Lavamos con agua destilada y secamos al aire

4.       Añadimos 2-3 gotas de nigrosina al 1% en un extremo del porta, que contiene el frotis, y extenderla por el método de la cuña

5.       Secamos al aire y observamos al microscopio con el objetivo de inmersión

RESULTADO

Se observa las bacterias teñidas de rojo sobre un fondo negro, y alrededor de ellas un halo blanco que sería la cápsula.

 

Práctica 9: Método de Anthony

OBJETIVO

Observar la cápsula de las bacterias capsuladas

MATERIAL Y REACTIVO

·         Portaobjetos

·         Asa de siembra

·         Mechero Bunsen

·         Suero salino fisiológico

·         Pinzas de madera

·         Cristal violeta

·         Sulfato de cobre al 20%

·         Paralelas

·         Cubeta de tinción

·         Frasco lavador con agua destilada

·         Microscopio óptico

·         Aceite de inmersión

PROCEDIMIENTO

1.       Realizamos un frotis utilizando un cultivo de 24 horas sin fijar

2.       Añadimos cristal violeta durante 1min

3.       Lavamos con solución saturada de sulfato de cobre al 20% para aumentar la refringencia de la cápsula

4.       Dejamos secar y observar al microscopio con el objetivo de inmersión

RESULTADO

La cápsula se observa como un halo transparente ligeramente azulado alrededor de la bacteria que se tiñe de violeta.